24.01.2016

Остеопластический материал линии "Ксеноплант" на основе ксеногенного деминерализованного костного матрикса (ДКМ) и рекомбинантного белкового остеоиндуктора (rhBMP-2)

ОСТЕОПЛАСТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ ЛИНИИ «КСЕНОПЛАНТ» НА ОСНОВЕ КСЕНОГЕННОГО ДЕМИНЕРАЛИЗОВАННОГО КОСТНОГО МАТРИКСА (ДКМ) И РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКОВОГО ОСТЕОИНДУКТОРА (rhВМР-2)


Зайцев В.В.1, 2; Есипов Р.С. 3; Селезнева И.И.4; Васильев М.Г.1,2;

Лукина Ю.С. 1,2; Мартынов А.Д.1; Поважный Д.Б.1


1 ООО «Ксеноплант»;

2 ФГБУ «ЦИТО им. Н.Н. Приорова» Минздрава Р.Ф.;

3 ФГБУ «ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН;

4 ФГБУ «Институт теоретической и экспериментальной биофизики» РАН.


Согласно современным исследованиям, наиболее перспективным направлением повышения остеоиндуктивности костных имплантатов и усиления регенерации соединительной ткани является создание биокомпозиционных материалов, содержащих основные компоненты биологической ткани и рекомбинантные костные морфогенетические белки человека (rhВМР) [1].


В настоящее время биокомпозиционные остеопластические имплантаты, содержащие rhВМР, занимают 44% мирового рынка остеозамещающих материалов, синтетические кальций-фосфатные материалы – 30%, деминерализованный костный матрикс, в основном аллогенного происхождения – 26% [2,3].


В 2012-2015 годах наибольший темп роста коммерческой реализации, равный 16,5%, отмечался в сегменте рынка остеопластических материалов, содержащих рекомбинантные белковые факторы роста (rhВМР), в то время как объемы реализации синтетических костных имплантатов и деминерализованного костного матрикса увеличивались ежегодно на 7,75% и 7,8% соответственно [3].


С учетом выраженного мирового тренда на интенсификацию исследований, направленных на возможность повышения остеоиндуктивных свойств костных имплантатов с помощью применения рекомбинантных белковых остеоиндукторов, представляется оправданной и актуальной с экономической и научной точки зрения разработка отечественных остеопластических материалов содержащих рекомбинантные костные морфогенетические белки (rhВМР).


ООО «Ксеноплант» совместно с научно-исследовательскими центрами Российской Федерации проводит исследования по созданию линии высокоостеоиндуктивных материалов на основе биологических и синтетических матриксов, содержащих рекомбинантные белковые остеоиндукторы (rhВМР) отечественного производства.


Разрабатываемая технология изготовления остеопластических материалов нового поколения, подразумевает использование rhВМР, фиксированных на ксеногенном костном матриксе или биокомпозиционных кальций-фосфатных носителях.


Целью данного исследования была оценка остеоиндуктивности рекомбинантного костного морфогенетического белка (rhВМР-2), отечественного производства при совместном использовании с ксеногенным деминерализованным костным матриксом в модельных исследованиях «in vitro» и «in vivo». 

Исследования «in vitro» проводили на первичной культуре клеток пульпы зуба человека, в тестах «in vivo» использовали модель сегментарного дефекта большеберцовой кости крыс линии «Wistar».


МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ


Получение rhВМР-2


Синтетический ген bmp2 получали химико-ферментативным способом с помощью реакции ПЦР с последующим клонированием в плазмидный вектор, который использовали для получения штамм-продуцента rhBMP-2 на основе E.coli ER2566.


Выделение и очистку костного морфогенетического белка 2 (рис. 1) проводили по модифицированному протоколу на гепарин-сефарозной колонке. Используемая модификация метода значительно увеличила выход целевого димера ВМР-2.


Рис. 1. Электрофоретический анализ стадий выделения rhBMP-2, 15 % ПААГ в денатурирующих условиях. Колонки: 1 − стандарты молекулярных масс; 2 − тотальный клеточный лизат продуцента ER2566/pER-bmp2; 3 − тела включения после ультразвуковой дезинтеграции клеток продуцента ER2566/pER-bmp2; 4 − супернатант после ультразвуковой дезинтеграции клеток продуцента ER2566/pER-bmp2; 5 − ренатурат rhBMP-2 («А» в образце присутствует ДТТ); 6 − ренатурат rhBMP-2 («Б» в образце отсутствует ДТТ)


Анализ полученных фракций белка проводили на аналитической колонке YMC-PackOctyl 150´2.1 мм S-5 µм 30 нм. Вторая фракция содержала целевой белок с чистотой не менее 98% (рис.2). Конечный продукт лиофилизировали.


Рис. 2. Препаративная ОФ ВЭЖХ rhBMP-2 человека на колонке Диасорб-130-С16Т 16´250 в градиенте асетонитрила 30-80 % со скоростью 5 мл/мин. Серым выделены фракции, содержащие целевой продукт с хроматографической чистотой более 98%


Получение ДКМ


Ксеногенный деминерализованный костный матрикс (ДКМ) изготавливали из губчатого слоя большеберцовой кости крупного рогатого скота. После механической фрагментации до необходимых размеров производили биохимическую очистку от белковых и жировых компонентов с использованием протеолитических ферментов, поверхностно-активных веществ и окислителей в условиях вакуума и воздействия ультразвука.


Деминерализацию химически очищенного костного матрикса проводили с помощью соляной кислоты, с последующим погашением кислотной активности путем щелочного титрования.


Для исключения фоновых значений остеоиндуктивности перед имплантацией деминерализованный костный матрикс обрабатывали 4М солянокислым гуанидином.


In vitro исследования биоактивности rhBMP-2 на культуре клеток пульпы зуба человека


Лиофильно высушенную фракцию rhBMP-2 растворили в концентрации 1мг/мл в фосфатном буфере pH=5,5 (НПП Пан Эко), профильтровали через мембранные фильтры (Millipore) с диаметром пор 0,22 мкм и развели средой ДМЕМ/F12 (НПП Пан Эко) до концентрации 100 мкг/мл.


Исследование биологической активности rhBMP-2 было проведено с использованием первичной культуры клеток пульпы зуба (Th1), выделенных из зачатка третьего моляра, извлеченного по ортодонтическим показаниям у здорового пациента 16 лет. Клетки извлекли из пульпы зуба промывкой струей среды ДМЕМ/F12, содержащей 200Ед/мл пенициллина и 200мкг/мл стрептомицина (ОАО Биохимик) через иглу шприца, вставленную в верхушку канала зуба. Выделенные клетки собрали центрифугированием в течение 2 минут при 1500 об/мин, подвергли обработке раствором 0,25% трипсин-0,02%ЭДТА (НПП ПанЭко) в течение 30 минут при 37оС, собрали центрифугированием и культивировали в среде ДМЕМ/F12 (1:1) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS, Thermo Fisher Scientific Cat №SV30160) и 100 Ед/мл пенициллин-стрептомицина в атмосфере 5% СO2.


Проведенная цитофенотипическая характеристика показала, что полученная культура клеток положительна по маркерам дифференцировки CD44, CD90, CD105, характерным для мультипотентных клеток мезенхимального ряда, и отрицательна по маркерам CD34, CD45 и HLA-DR, характерным для гемопоэтических клеток, при этом данные клетки способны дифференцироваться в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлениях, что позволяет говорить об их принадлежности к мезенхимальным стволовым клеткам [4].


Клетки переводили в суспензию, используя раствор 0,25% трипсин-0,02%ЭДТА и высевали в лунки 96-луночного культурального планшета (NUNC) в количестве 50 тыс/см2. Через 18 часов и на 4 сутки после посева клеток проводили полную замену среды в лунках на среду, содержащую 100мкг/мл rhBMP-2. Дифференцировочную активность клеток оценивали через 7 суток культивирования путем окраски соединений кальция ализариновым красным и определения активности в клетках щелочной фосфатазы. 


Определение степени кальцификации клеточной культуры


Определение степени кальцификации проводили путем окрашивания отложений фосфорнокислого кальция красителем Alizarin Red (pH = 4.1). Для этого после окончания культивирования клетки были промыты 0,01 М фосфатным буфером (рН=7,4) и зафиксированы в течение 20 минут в 3,7% забуференном растворе формальдегида.


После удаления фиксатора и промывки деионизованной водой клетки были окрашены 2% раствором ализаринового красного в течение 5 минут для выявления образования минерализованного матрикса. Оценку морфологии клеток и количества кальцификатов проводили на микроскопе Axiovert 200 (Карл Цейс, Германия).


Полуколичественное определение степени окрашивания соединений кальция проводили путем измерения оптической плотности при длине волны 490 нм с помощью фотометра (модель 680 BIO-RAD, США).


Определение активности щелочной фосфатазы в клеточной культуре


Определение активности щелочной фосфатазы проводили с использованием набора реагентов (Alkalinephosphatasekit, Sigma 86-R) согласно инструкции производителя. Оценку морфологии и окрашивания клеток проводили на микроскопе Axiovert 200 (Карл Цейс, Германия).


Полуколичественное определение степени окрашивания клеток проводили путем измерения оптической плотности при длине волны 490 нм с помощью фотометра (модель 680 BIO-RAD, США).


In vivo исследования биоактивности rhBMP-2, фиксированного на ксеногенном ДКМ (губчатый слой), на экспериментальной модели сегментарной резекции большеберцовой кости крысы


Эксперименты проводились на, половозрелых самцах крысы линии «Wistar», весом 180 гр. Резекцию большеберцовой кости производили в асептических условиях, после кетаминового наркоза. Диастаз формировали путем иссечения 5 мм костного сегмента с последующей имплантацией исследуемого ксеногенного ДКМ, содержащего rhВМР-2. Проксимальный и дистальный концы резецированной большеберцовой кости стабилизировали на одной оси с помощью титанового штифта, закрепленного в костномозговом канале. 


Оперативное вмешательство у одного животного производили одновременно на левой и правой большеберцовой кости, соответственно контрольное и опытное наблюдение. 


«Контрольное наблюдение»


Остеосинтез большеберцовой кости левой задней лапы экспериментального животного, положении «на спине». В костный диастаз имплантировали ксеногенный ДКМ, обработанный 1% солянокислым гуанидином.


«Опытное наблюдение»


Остеосинтез большеберцовой кости правой задней лапы экспериментального животного, в положении «на спине». В костном диастазе фиксировали ксеногенный ДКМ, обработанный 1% солянокислым гуанидином, содержащий 0,25 мгrhВМР-2.


Срок имплантации исследуемых материалов составил 26 суток (одно животное) и 47 суток (3 животных).

Оценку остеоиндуктивности остеопластического материала на основе ксеногенного ДКМ, содержащего rhВМР-2 производили путем оценки выраженности регенераторного процесса в области костной резекции с помощью рентген-томографической денситометрии, томографического и гистологического исследований на 26 и 47 сутки после оперативного вмешательства.


Рентгено-томографическая денситометрия


Сравнительную оценку плотности вновь образованного костно-хрящевого регенерата производили с помощью рентген-томографической денситометрии на микротомографе «SkyScan 1176» с построением графика распределения плотности по шкале Хаусфильда для опытного и контрольного образцов аутопсийного материала.


Томографическое исследование


Томографическое исследование аутопсийного материала, полученного в различные сроки после имплантации, проводили с помощью микротомографа «SkyScan 1176» c последующим построением 3D моделей с использованием компьютерной программы «Avisio 7».


Гистологическое исследование


Аутопсийный материал, полученный в различные сроки наблюдения, фиксировали в 10% формалине на фосфатном буфере рН 7,2-7,4. Декальцинацию проводили в 7% азотной кислоте. Полученный декальцинированный материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали парафином. Из полученных парафиновых блоков изготавливались срезы толщиной 7-8 мкм с последующей окраской гематоксилином и эозином. Полученные гистологические препараты исследовали на световом микроскопе Nikon E200.


Статистический анализ


Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Origin 8.1, за ошибку принимали среднеквадратичное отклонение от среднего значения, за достоверные принимали различия по U-критерию Манна – Уитни при р<0,05.


РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ


Оценка влияния rhВМР-2 на пролиферативную и дифференцировочную активность клеток


Для оценки биологического влияния rhВМР-2 были использованы клетки пульпы третьих моляров (зубов мудрости) человека. По своим морфологическим и фенотипическим свойствам эти клеточные популяции аналогичны мезенхимальным стволовым клеткам человека, поскольку они обладают свойством клоногенности, способны пролиферировать как в условиях «in vitro», так и «in vivo», характеризуются мультипотентностью направлений дифференцировки [4]. Было показано, что рекомбинантный костный морфогенетический белок 2 (rhВМР-2) при концентрации 100 мкг/мл активно стимулирует дифференцировку клеток Th-1 в остеогенном направлении (рис. 3), что подтверждает наличие большого количества кальцификатов и повышенного уровня экспрессии щелочной фосфатазы.


Рис. 3. Внешний вид клеток пульпы человека, инкубировавшихся в течение 7 суток в среде ДМЕМ/F12 + 10% ЭТС: в контроле (А, В) и при добавлении 100мкг/мл BMP-2 (Б, Г). Выявление кальцификатов ализариновым красным (А, Б) и определение экспрессии щелочной фосфатазы (В, Г). Линейка 100 мкм


В культуре клеток наблюдается образование кластеров клеток, характеризующихся высоким уровнем экспрессии щелочной фосфатазы и образованием кальцификатов, свидетельствующее о гетерогенности популяции. Фотометрическое определение степени кальцификации клеток и уровня экспрессии щелочной фосфатазы позволило провести сравнение этих величин и показать статистически значимое возрастание данных параметров в опыте по сравнению с контролем (рис. 4).


Рис. 4. Результаты фотометрического определения кальцификатов (1) и выявления экспрессии щелочной фосфатазы (2) в клетках пульпы человека, инкубировавшихся в течение 7 суток в среде ДМЕМ/F12 + 10 % ЭТС в контроле (А, В) и при добавлении 100мкг/мл rhВМР-2


In vivo исследования биоактивности rhBMP-2, фиксированного на ксеногенном ДКМ (губчатый слой), на экспериментальной модели сегментарной резекции большеберцовой кости крысы


Томографическое исследование


«Контрольное наблюдение» имплантация ДКМ


У всех экспериментальных животных на 26 или 47 сутки после операции не отмечалось образования регенерата и костного сращения (рис. 5).


Рис. 5. Остеосинтез большеберцовой кости «конец в конец», интрамедуллярная фиксация. «Контрольное наблюдение». Имплантация ДКМ в диастаз большеберцовой кости


«Опытное наблюдение» имплантация ДКМ+ rhВМР-2


У всех животных было отмечено образование костного регенерата, при сроке наблюдения 47 суток после операции костный регенерат был более выражен, чем в срок 26 суток. У двух животных отмечалось хорошо различимое костное сращение между проксимальным и дистальным концом резецированной большеберцовой кости. У одного животного отмечалась выраженная кальцификация имплантированного деминерализованного костного матрикса (рис. 6).


Рис. 6. Остеосинтез большеберцовой кости «конец в конец», интрамедуллярная фиксация «Опытное наблюдение». Имплантация в диастаз большеберцовой кости ДКМ+rhВМР-2


При извлечении титанового фиксирующего штифта из костномозгового канала большеберцовой кости во всех опытных образцах требовалось значительное физическое усилие. В противоположность «Опытным» образцам, в «Контрольных» образцах у одного и того же животного удаление титанового штифта не требовало значительных физических усилий.


Рентген-томографическая денситометрия


«Контрольное наблюдение» имплантация ДКМ


Рентгенографическая плотность ткани в области костного дефекта с имплантированным ДКМ была менее 400 HU. В зоне костного диастаза отсутствуют ткани с усредненной плотностью более 500 HU, характерной для костно-хрящевого регенерата, кроме наблюдений у двух животных, в которых отмечаются незначительные фрагменты костной ткани, являющиеся техническими артефактами, которые визуализировались в зоне диастаза как естественные неровности резецированной кости со стороны дистального и проксимального концов (рис. 7).

Рис. 7. Рентген-томографическая денситометрия. Распределение плотности костно-хрящевого регенерата по шкале Хаусфильда


«Опытное наблюдение» имплантация ДКМ+rhВМР-2


Во всех исследуемых образцах отмечена усредненная максимальная плотность ткани от 600 до 1200 HU, что указывает на присутствие регенерата с характеристиками, соответствующими хрящевой и вновь образованной костной тканям, которые по плотности все же меньше, чем плотность пластинчатой костной ткани неоперированного животного (до 2600 HU), но соответствуют ей по объему.


Гистологическое исследование


«Контрольное наблюдение»: имплантация ДКМ


На 26 и 47 сутки, в области дефекта развивается первичная костная мозоль, состоящая из грубоволокнистой соединительной ткани, представляющей собой беспорядочно переплетенные коллагеновые волокна и большое количество фибробластов. В толще соединительнотканной мозоли различимы островки хрящевых клеток - хондроцитов, формирующие на ограниченных участках слабо выраженную, по сравнению с «Опытным наблюдением», хрящевую ткань. Деминерализованный костный матрикс окружен волокнистой соединительной тканью, указывающей на инкапсуляцию импланта. Отмечаются признаки хронического воспаления, и слабо выраженного ангиогенеза в толще имплантата. В образцах, взятых на 47 сутки, в пространствах между трабекулами отмечалось присутствие гемопоэтического компонента (рис. 8).


Рис. 8. Формирование участков хрящевой ткани со стороны костного имплантата, разрастание соединительной ткани Опытная группа. 47 сутки после операции. Окр. гематоксилин-эозин. Ув. х100


«Опытное наблюдение» Имплантация ДКМ+rhВМР-2


На 26 и 47 сутки после остеосинтеза на периферии исследуемого остеопластического материала, содержащего rhВМР-2, располагается хрящевая ткань с крупными пузырчатыми хондробластами. Количество хрящевой ткани больше, чем в «Контрольной» группе (имплантация ДКМ не содержащего белкового остеоиндуктора). Имплантированный деминерализованный губчатый костный матрикс подвергся активной ферментативной биодеградации. Отмечается прорастание новообразованных кровеносных сосудов между трабекулами имплантата (рис. 9).


Рис. 9. Вновь образованная костная ткань, грубоволокнистая соединительная ткань. Опытная группа. 60 сутки после операции. Окр. гематоксилин-эозин. Ув. х100


Центральная часть деминерализованного костного матрикса на 26 сутки заполнена трабекулами грубоволокнистой костной ткани и рыхлой волокнистой соединительной тканью. На 47 сутки образующиеся костные пластинки имеют незрелый характер: беспорядочно ориентированы, на их поверхности находится большое количество фибробластов. В толще новообразованных костных трабекул содержится много остеобластов и некоторое количество остеоцитов. Между костными трабекулами в ячейках ретикулярной ткани располагаются кроветворные островки.


Часть трабекул представляет собой участки незавершенного остеогенеза – виден переход от хрящевой структуры к костной. 


В «Опытных наблюдениях», по сравнению с «Контрольными наблюдениями», отмечено более интенсивное и направленное вдоль длинной оси бедренной кости образование хрящевой мозоли, которая по своему строению напоминает метафизарную ростовую платинку кости. Хрящевая ткань располагается непосредственно на поверхности имплантированного деминерализованного губчатого костного матрикса, возможно, используя его как трехмерную матричную структуру.


Гистологическая картина была характерной для регенерации костной ткани при массивных повреждениях, развивающейся по механизму непрямого энхондрального остеогенеза.


Данные изменения в совокупности является характерными для выраженного процесса регенерации в зоне имплантации остеопластического материала с признаками биодеградации и начальной минерализации костного матрикса. В области имплантации рыхлая волокнистая соединительная ткань с признаками воспалительной реакции, что связано с реакцией организма на инородное тело с развитием процеса инкапсуляци и, вероятно, наличием остаточной имуногенности ксеногенного ДКМ носителя rhВМР-2.


ОБСУЖДЕНИЕ


Основные векторы исследований по совершенствованию костных имплантатов и разработки остеопластических материалов нового поколения связаны с поиском возможности химического или физического воздействия на характеристики остеопластического материала, главными из которых являются: остеоиндуктивность, биосовместимость, скорость резорбции в организме реципиента, размер поверхности связанный с открытой пористой системой матрикса, пластичность, механическая прочность [5].


Активизация остеоиндуктивности ксеногенных костных имплантатов может быть достигнута процессом деминерализации с добавлением рекомбинантных белковых остеоиндукторов [6].


Добавление rhВМР к биологическому коллагеновому носителю демонстрировало в экспериментах «in vivo» формирование новой кости, при этом остеоиндуктивность костного имплантата прямо пропорционально зависела от количества фиксированного на ДКМ rhВМР [7].


Проведенные предварительные исследования «in vivo» по оценке отечественного рекомбинантного белкового остеоиндуктора, фиксированного на ксеногенном деминерализованном костном матриксе, демонстрируют выраженные остеоиндуктивные характеристики по сравнению с ДКМ, изготовленным по стандартной технологии [8].


Деминерализованный костный матрикс, изготовленный на основе губчатого слоя ксеногенной кости и содержащий рекомбинантный белковый остеоиндуктор (rhВМР-2), стимулирует интенсивное образование хрящевой мозоли и служит трехмерной матричной структурой для роста хрящевой ткани, перестраивающейся в процессе регенерации во вновь образованную костную ткань.


Усредненная максимальная плотность (до 1000 HU) костно-хрящевого регенерата, образованного при использовании rhВМР-2, была меньше, чем костная ткань неоперированного животного (до 2600 HU), но соответствовала ей по объему.


Регенерация костной ткани в условиях экспериментального остеосинтеза «конец в конец» большеберцовой кости крысы линии «Wistar» при использовании разработанного остеоиндуктивного материала происходила по механизму непрямого остеогенеза.


В отличие от «Контрольной» группы (имплантация ДКМ), в «Опытной» группе (имплантация ДКМ+rhВМР-2) хрящевая мозоль занимала больший объем и напоминала по своему морфологическому строению метафизарную пластинку регенерации костной ткани.


Присутствие воспалительного инфильтрата в «Опытной» и «Контрольной» группах, возможно, связано с наличием остаточной имуногенности деминерализованного губчатого костного носителя rhВМР-2 или бактериальным инфицированием зоны остеосинтеза в послеоперационном периоде.


Согласно данным научной литературы, непредвиденной проблемой исследования остеоиндуктивных эффектов rhВМР, является их роль в активации остеокластов и стимулировании факторов способствующих неоправданно быстрой резорбции используемого биологического носителя. Возможно, что к остеокластической активности приводит выраженная остеобластическая активность, стимулированная наличием rhВМР в используемом носителе [9].


ВЫВОДЫ



  1. Исследование биологической активности рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 (rhВМР-2), проведенное с использованием мультипотентных клеток мезенхимального ряда, выделенных из пульпы зуба человека, показало его выраженное стимулирующее воздействие на дифференцировку клеток в остеогенном направлении.
  2. Остеопластический материал линии «Ксеноплант» на основе ксеногенного деминерализованного костного матрикса (ДКМ), содержащий рекомбинантный костный морфогенетический белок (rhВМР-2), обладает повышенной остеоиндуктивностью, стимулирует развитие остеогенеза с образованием выраженной хрящевой стадии регенерации и в экспериментах «in vivo» способствует образованию костного сращения при остеосинтезе длинных костей «конец в конец».



ЛИТЕРАТУРА



  1. Reddi A.H. BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 2005; 16(3):249–50.
  2. Nandi S.K, Roy S., Mukherjee P., Kundu B., De D.K, Basu D. Orthopaedic applications of bone graft & graft substitutes: a review. Indian Journal of Medical Research. 2010; 132(1): 15-30.
  3. Bone Graft Substitutes - Global Pipeline Analysis, Competitive Landscape and Market Forecast to 2017// GDME0097 — 2011.
  4. Pevsner—Fischer M.,Levin S.,Zipori D. The origins of mesenchymal stromal cell heterogeneity// Stem Cell Rev. — 2011. — Vol. 7, N 3. — P. 560-568.
  5. Seeherman H. and Wozney J.M. Delivery of bone morphogenetic proteins for orthopedic tissue regeneration//Cytokine Growth Factor Rev.—2005. — Vol. 16. — P. 329-345.
  6. Шарапова Н. Е., Котнова А. П., Галушкина З. М., и др. Получение рекомбинантного костного морфогенетического белка 2 человека в клетках Escherichia coli и тестирование его биологической активности in vitro и in vivo// Молекулярная биол. — 2010. — Т. 44, N 6. — С. 1036-1044.
  7. Wulsten D., Glatt V., Ellinghaus A. Time kinetics of bone defect healing in response to BMP-2 and GDF-5 characterized by in vivo biomechanics// European cells and materials — 2011. — Vol. 21. — P. 177-192.
  8. Миронов С.П., Гинцбург А.Л., Еськин Н.А. и др. Экспериментальная оценка остеоиндуктивности рекомбинантного костного морфогенетического белка (rhВМР-2), отечественного производства, фиксированного на биокомпозиционном или костном матриксе// Вестник травматологии и ортопедии имени Н.Н. Приорова — 2010. — N. 4. — С. 38-44.
  9. Smith H., Adaline E., Volkman S. et al. Mechanical environment alters tissue formation patterns during fracture repair// J. Orthop. Res. — 2004. — Vol. 22. — P. 1079-1085.



← Назад к списку