31.03.2016

Остеопластические материалы линии Ксеноплант на основе химически стабилизированного ксеногенного деминерализованного костного матрикса, содержащие рекомбинантные костные морфогенетические белки (доклиническая оценка в модельных исследованиях)

Скачать в формате PDF

ОСТЕОПЛАСТИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ЛИНИИ КСЕНОПЛАНТ НА ОСНОВЕ ХИМИЧЕСКИ СТАБИЛИЗИРОВАННОГО КСЕНОГЕННОГО ДЕМИНЕРАЛИЗОВАННОГО КОСТНОГО МАТРИКСА, СОДЕРЖАЩИЕ РЕКОМБИНАНТНЫЕ КОСТНЫЕ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЕ БЕЛКИ

(ДОКЛИНИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА В МОДЕЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ)


В.В. Зайцев1,2, Р.С. Есипов3, Н.В. Олейник3, Ю.С. Лукина1,2, М.Г. Васильев1,2, А.Д. Мартынов1, Д.Б. Поважный1


1 ООО «Ксеноплант», Москва

2 ФГБУ «Центральный научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии имени Н.Н. Приорова» Минздрава России, Москва

3 ФГБУН «Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, Москва


Остеопластические материалы на основе химически стабилизированного ксеногенного деминерализованного костного матрикса используются в технологии изготовления хирургических имплантатов и остеопластических материалов. Технология основана на трех базовых подходах:

- химическая стабилизация исходных матриксов,

- фиксация на матриксе-носителе рекомбинантных белковых факторов роста,

- модификация матриксов с помощью реагентов в сверхкритическом состоянии.


Ключевые слова: Ксеноплант, костные морфогенетические белки, стабилизация ксеногенного деминерализованного костного матрикса.


Osteoplastic materials of Xenoplant line based on chemically stabilized xenogenic demineralized bone matrix containing recombinant bone morphogenetic proteins (preclinical evaluation in model studies «in vivo»)


V.V. Zaytsev, R.S. Esipov, N.V. Oleynik, Yu.S. Lukina, M.G. Vasil'yev, A.D. Martynov, D.B. Povazhnyy


Currently osteoplastic materials applied in orthopedics. This became possible with introduction of chemical stabilization of xenogenic bone matrix. The technology is based on three basic approaches: chemical stabilization of initial matrix, fixing of recombinant proteinaceous growth factors on the carrier matrix, modification of matrix by means of reagents in supercritical condition.


Keywords: Xenoplant, bone morphogenetic proteins, stabilization of the xenogenic demineralized bone matrix.


Среди всех видов остеопластических материалов, применяемых в настоящее время в мировой остеологии, куда входят нейрохирургия, травматология, ортопедия, стоматология, челюстно-лицевая и детская хирургия, 44% составляют материалы, содержащие белковые факторы роста, костные морфогенетические белки (rhBMP), 30% - синтетические кальций-фосфатные остеозамещающие материалы, и 26% - деминерализованный костный матрикс [1].


Серьезным недостатком известных вариантов остеопластических материалов является полное отсутствие или непредсказуемое значение биологической активности (остеоиндуктивности), неконтролируемая ускоренная резорбция в условиях организма, пониженная биосовместимость [2, 3].


Обеспечение структурной стабильности имплантата или устойчивости к резорбции, синхронизированной по времени с процессом регенерации, является одной из главных научно-технологических проблем остеопластических материалов и хирургических имплантатов.


Химическая стабилизация исходных матриксов - это особая, нестандартная стабилизация биологических и биокомпозиционных носителей которая обеспечивает формирование структурной стабильности и устойчивости к выраженной макрофагальной резорбции и синхронизации по времени процесса резорбции и локальной регенерации.


Имплантируемые биологические или биокомпозиционные материалы при наличии выраженного естественного, не стимулированного, регенераторного процесса или искусственно сформированной биологической активности (повышение остеоиндуктивности при фиксации rhВМР), подвержены ускоренной, неконтролируемой резорбции, что в абсолютном большинстве случаев приводит к неэффективности хирургического вмешательства с формированием клинически значимых осложнений.


Стабилизация матриксов с помощью известных и, к сожалению, распространенных технологических решений, (применение химических сшивающих реагентов по стандартным схемам) приводит к обратному эффекту - абсолютной резорбционной устойчивости имплантата в организме реципиента с формированием ограничительной фиброзной капсулы, макрофагальной реакции и кальцификации, а частичная химическая сшивка стимулирует процесс иммунного отторжения с выраженной воспалительной реакцией.


Технология Ксеноплант основана на применении химических сшивающих реагентов в особых концентрациях и режимах для получения биологических (на основе коллагена первого типа) матриксов с пониженной иммуногенностью и возможностью «мягкой» ферментативной резорбции без формирования выраженной макрофагальной атаки.


Нами впервые в модельных исследованиях «in vivo» проведена оценка остеоиндуктивности химически стабилизированного ксеногенного деминерализованного костного матрикса (ДКМ), содержащего рекомбинантный костный морфогенетический белок (rhBMP-2) отечественного производства.


Получение rhBMP-2.


Синтетический ген ВМР-2 получали химико-ферментативным способом с помощью реакции ПЦР, с последующим клонированием в плазмидный вектор, который использовали для получения штамм-продуцента rhBMP-2 на основе E. coli ER2566.


Получение ДКМ.


Ксеногенный деминерализованный костный матрикс (ДКМ) изготавливали из губчатого слоя большеберцовой кости крупного рогатого скота. После механической фрагментации до необходимых размеров, в условиях вакуума и воздействия ультразвука, производили ее биохимическую очистку от белковых и жировых компонентов, с использованием протеолитических ферментов, поверхностно активных веществ и окислителей.


Деминерализацию химически очищенного костного матрикса проводили с помощью соляной кислоты, с последующим погашением кислотной активности путем щелочного титрования.


Для исключения фоновых значений остеоиндуктивности перед имплантацией деминерализованный костный матрикс обрабатывали 4М солянокислым гуанидином.


С целью оценки возможности регулирования скорости ферментативной резорбции, ксеногенный ДКМ химически стабилизировали путем обработки 0,6% глутаровым альдегидом на фосфатном буфере.


Далее, rhBMP-2 растворяли из лиофилизированного состояния в фосфатном буфере рН 5,5; в концентрации 0,25 мг на грамм костного матрикса его однократно инъекцировали в ДКМ, фиксированный в диастазе большеберцовой кости экспериментального животного.


Техника оперативного вмешательства.


Эксперименты проводились на половозрелых самцах крысы линии «Wistar», весом 180 г. Резекцию большеберцовой кости осуществляли в асептических условиях, после кетаминового наркоза. Диастаз формировали путем иссечения 5 мм костного сегмента, с последующей имплантацией исследуемого ксеногенного ДКМ, содержащего rhВМР-2. Проксимальный и дистальный концы резецированной большеберцовой кости стабилизировали на одной оси с помощью титанового штифта, закрепленного в костномозговом канале.


Оперативное вмешательство у одного животного производили одновременно на левой и правой большеберцовой кости.


«Контрольное наблюдение» (ДКМ) - большеберцовая кость левой задней лапы экспериментального животного, в положении «на спине». В костный диастаз имплантировали ксеногенный ДКМ, обработанный 1% солянокислым гуанидином.


«Опытное наблюдение» (ДКМ+0,6% глутаровый альдегид+rhВМР-2) - большеберцовая кость правой задней лапы экспериментального животного, в положении «на спине». В костном диастазе фиксировали ксеногенный ДКМ, обработанный 1% солянокислым гуанидином и стабилизированный, с однократным инъекцированием 0,25 мг rhВМР-2 в имплантированный ДКМ.


У пяти экспериментальных животных продолжительность имплантации исследуемых материалов составила 60 суток.


Оценку остеоиндуктивности остеопластического материала на основе ксеногенного ДКМ, содержащего rhВМР-2, производили путем оценки выраженности регенераторного процесса в области костной резекции, с помощью рентген-томографической денситометрии, томографического и гистологического исследований на 60-е сутки после оперативного вмешательства.


Рентген-томографическая денситометрия.


Сравнительную оценку плотности вновь образованного костно-хрящевого регенерата производили с помощью рентген-томографической денситометрии, на микротомографе «SkyScan 1176», с построением графика распределения плотности по шкале Хаусфильда для опытного и контрольного образцов аутопсийного материала.


Томографическое исследование.


Томографическое исследование аутопсийного материала, полученного в различные сроки после имплантации, выполняли с помощью микротомографа «SkyScan 1176», c последующим построением 3D моделей с использованием компьютерной программы «Avisio 7».


Гистологическое исследование.


Аутопсийный материал, полученный в 60-й день наблюдения, фиксировали в 12% формалине на фосфатном буфере рН 7,2-7,4. Декальцинацию проводили в 15% азотной кислоте. Полученный декальцинированный материал обезвоживали спиртом и заливали парафином, с последующей окраской гематоксилином и эозином.


Полученные гистологические препараты исследовали на световом микроскопе Nikon E200.


Томографическое исследование.


Остеосинтез большеберцовой кости «конец в конец», интрамедуллярная фиксация.


«Контрольное наблюдение» (ДКМ). У всех животных отмечалась выраженная ферментативная биодеградация имплантированного деминерализованного костного матрикса, а также визуально различимое отсутствие регенерации костной ткани. Во всех наблюдениях данной серии отмечено полное смыкание проксимального и дистального концов резецированной большеберцовой кости, отсутствие визуализации имплантированного ДКМ (рис. 1).


Рис. 1. Остеосинтез большеберцовой кости «конец в конец», интрамедуллярная фиксация. «Контрольное наблюдение»: имплантация в диастаз большеберцовой кости нестабилизированного ДКМ. Срок наблюдения 60 суток после операции


«Опытное наблюдение» (ДКМ+0,6% глутаровый альдегид+rhВМР-2). Визуально различимое отсутствие ферментативной резорбции, аутологичная костная ткань экспериментального животного, прилежащая в сформированном костном диастазе к ДКМ, демонстрировала умеренную активность регенераторного процесса, менее выраженного по сравнению с ДКМ, не стабилизированным глутаровым альдегидом. Отмечено сохранение исходного размера костного диастаза, несмотря на значительную пористость имплантированного ДКМ (рис. 2).


Рис. 2. Остеосинтез большеберцовой кости «конец в конец», интрамедуллярная фиксация. «Опытное наблюдение»: имплантация в диастаз большеберцовой кости ДКМ, стабилизированного 0,6% глутаровым альдегидом, фиксация rhВМР-2. Срок наблюдения 60 суток после операции


Рентген-томографическая денситометрия. Распределение плотности костно-хрящевого регенерата по шкале Хаусфильда.


«Контрольное наблюдение» (ДКМ). Вследствие попадания в зону анализа фрагментов костной ткани при сближении проксимального и дистального концов резецированной большеберцовой кости и закрытия диастаза при полной резорбции имплантированного ДКМ, возможен анализ только наблюдения №153, в котором плотность ткани приближается к нулевой отметке, указывающей на отсутствие регенераторного процесса (рис. 3).


Рис. 3. Результаты рентген-томографической денситометрии. Распределение плотности костно-хрящевого регенерата по шкале Хаусфильда. «Контрольное» наблюдение»: имплантация в диастаз большеберцовой кости ДКМ. «Опытное наблюдение»: имплантация в диастаз большеберцовой кости ДКМ, стабилизированного 0,6% глутаровым альдегидом, фиксация rhВМР-2. Срок наблюдения 60 суток после операции


«Опытное наблюдение» (ДКМ+0,6% глутаровый альдегид+ rhВМР-2). Плотность ткани превышает значение 500 HU (№152 до 2000HU), что, возможно, указывает на повышение плотности имплантированного ДКМ при химической сшивке глутаровым альдегидом, а также - слабовыраженный регенераторный процесс (рис. 3).


Гистологическое исследование.


Остеосинтез большеберцовой кости «конец в конец», интрамедуллярная фиксация.


«Контрольное наблюдение» (ДКМ). На 60-е сутки, в области дефекта формируется костная мозоль, состоящая из грубоволокнистой соединительной ткани. В толще соединительнотканной мозоли можно обнаружить единичные хондроциты. Процессы биодеградации резко снижены. Большая часть новообразованной костной ткани представляет собой участки незавершенного остеогенеза - очевиден переход от хрящевой структуры к костной. Деминерализованный костный имплантат инкапсулирован. Отмечены признаки хронического воспаления и слабое прорастание сосудов в толщу имплантата (рис. 4).


Рис. 4. «Контрольное наблюдение». Имплантация в диастаз большеберцовой кости ДКМ. Срок наблюдения 60 суток после операции


«Опытное наблюдение» (ДКМ + 0,6% глутаровый альдегид +rhВМР-2). На 60-е сутки в области дефекта формируется костная ткань, состоящая из грубоволокнистой соединительной ткани и новообразованной костной ткани. По периферии имплантата наблюдаются островки хрящевой ткани по типу метафизарной ростовой пластинки; процессы биодеградации средней - степени выраженности. Меньшая часть новообразованной костной ткани представляет собой участки незавершенного остеогенеза: виден переход от хрящевой структуры к костной. Вокруг деминерализованного костного имплантата практически отсутствуют признаки воспаления, отмечается слабое прорастание сосудов в толщу имплантата (рис. 5).


Рис. 5. Гистологическое исследование аутопсийного материала. Оценка ксеногенного костного матрикса на модели остеосинтеза большеберцовой кости «конец в конец» Имплантация ДКМ в диастаз большеберцовой кости (срок имплантации 60 суток)


В настоящее время основные векторы исследований по совершенствованию остеопластических материалов на основе биологических матриксов связаны с поиском возможности химического или физического воздействия на биологические характеристики матрикса, главными из которых являются: остеоиндуктивность, биосовместимость, скорость резорбции в организме реципиента, размер поверхности, пористость, пластичность, механическая прочность [4].


Повышение остеоиндуктивности костных имплантатов может быть достигнуто процессом деминерализации кости, с добавлением рекомбинантных белковых остеоиндукторов (rhBMP) [5].


Добавление rhBMP к биологическому коллагеновому носителю демонстрировало в экспериментах «in vivo» новое формирование кости, при этом остеоиндуктивность костного имплантата прямо пропорционально зависела от количества фиксированного на ДКМ rhBMP.


Деминерализованный костный матрикс, изготовленный на основе губчатого слоя ксеногенной кости, содержащий рекомбинантный белковый остеоиндуктор (rhBMP-2), стимулирует интенсивное образование хрящевой мозоли и служит трехмерной матричной структурой для роста хрящевой ткани, перестраивающейся в процессе регенерации во вновь образованную костную ткань.


Усредненная максимальная плотность (до 1200 HU) костно-хрящевого регенерата, образованного при использовании rhBMP-2, была меньше, чем костная ткань неоперированного животного (до 3500 HU), но соответствовала ей по объему.


Регенерация костной ткани в условиях экспериментального остеосинтеза «конец в конец» бедренной кости крысы линии «Wistar», при использовании разработанного остеоиндуктивного материала, происходила по механизму непрямого остеогенеза.


В отличие от «контрольной» группы (имплантация ДКМ), в «опытной» группе (имплантация ДКМ+rhВМР-2) хрящевая мозоль занимала больший объем и напоминала по своему морфологическому строению метафизарную пластинку регенерации костной ткани.


Присутствие воспалительного инфильтрата в «опытной» и «контрольной» группах, возможно, связано с наличием остаточной иммуногенности деминерализованного губчатого костного носителя rhBMP-2 или бактериальным инфицированием зоны остеосинтеза в послеоперационном периоде.


Согласно данным научной литературы, непредвиденной проблемой исследования остеоиндуктивных эффектов rhВМР, оказалась их роль в активации остеокластов и стимуляции факторов, способствующих неоправданно быстрой резорбции используемого биологического носителя. Возможно, что к остеокластической активности приводит выраженная остеобластическая активность, стимулированная наличием rhВМР в используемом носителе [6].


В результате проведенных исследований можно отметить, что химически не стабилизированный деминерализованный костный матрикс (ДКМ) на основе губчатого слоя кости, содержащий rhВМР-2, без включения рекомбинантного белкового остеоиндуктора, подвержен активной биологической резорбции при воздействии макрофагов или остеокластов, отсутствии или наличии костной регенерации соответственно, в различные сроки имплантации в диастазе большеберцовой кости крысы при остеосинтезе «конец в конец».


Оптимизацию скорости резорбции биологических носителей, синхронизированной по времени с процессом образования новой кости возможно осуществлять путем химической стабилизации с помощью сшивающих реагентов (глутаровый альдегид). Однако при этом необходимо решать проблемы токсичности обработанного матрикса, приводящей к торможению остеоидной дифференцировки мезенхимальных клеток-предшественников и замедлению процесса регенерации костной ткани. Необходимо учитывать, что цитотоксический эффект зависит от концентрации используемого для химической стабилизации глутарового альдегида и времени отмывки биологического носителя от сшивающего реагента.


Процессы регенерации костной ткани отмечены как в нестабилизированном имплантате, так и в химически стабилизированном, с различием, которое заключается в том, что в стабилизированных имплантатах процессы биодегенерации и регенерации несколько снижены. Наилучшие результаты получены в образцах, содержащих rhВМР-2.


Полученные результаты по оценке остеоиндуктивности ДКМ на основе губчатого слоя ксеногенной кости указывают на возможность регулирования скорости резорбции деминерализованного костного носителя rhВМР. Важно также отметить, что при этом имеет место некоторое торможение регенераторного процесса. Это, возможно, связано с цитотоксическим эффектом глутарового альдегида и остеоиндуктивным эффектом используемого rhВМР-2 [7].


Для повышения остеоиндуктивного воздействия rhВМР, при необходимости его совместного применения с сшивающими реагентами, актуальным является разработка технологии химической стабилизации биологических матриксов, связанная с поиском оптимальных соотношений между концентрацией rhВМР на биологическом матриксе, степенью деминерализации ДКМ, концентрацией сшивающего реагента.


Таким образом, остеопластический материал на основе ксеногенного деминерализованного костного матрикса, содержащий рекомбинантный костный морфогенетический белок (rhВМР-2), обладает повышенной остеоиндуктивностью, стимулирует развитие остеогенеза по эмбриональному пути с образованием выраженной хрящевой пластины регенерации и способствует образованию костного сращения при остеосинтезе «конец в конец» с интрамедуллярной фиксацией большеберцовой кости крысы линии «Wistar».


Доклиническая оценка продукта указывает на эффективность разработанного технологического решения, результатом которого является синхронизация по времени резорбции матрикса и образования соединительно тканного (костного) регенерата в области хирургической фиксации костного имплантата.


Дальнейшее совершенствование технологии получения остеопластических материалов на основе биологических матриксов, содержащих rhВМР, связано с процессом химической стабилизации биологической ткани носителя с целью синхронизации по времени скорости резорбции биологического носителя и времени образования новой кости.


Литература


1. Bone Graft Substitutes - Global Pipeline Analysis, Competitive Landscape and Market Forecast to 2017// GDME0097 — 2011.


2. Reddi AH.; «BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins»//Cytokine Growth Factor Rev.-2005- vol.16 - p. 249-250.


3. The evolving role of bone graft substitutes, American Academy of Orthopaedic Surgeons, 77th Annual Meeting - 2010-March 9-13- New Orleans, Lousisana


4. Bone Graft Substitutes-Global Pipeline Analysis, Competitive Landscape and Market Forecast to 2017// GDME0097MAR- 2011- jul.-p1-88.


5. Seeherman H. and Wozney J.M. Delivery of bone morphogenetic proteins for orthopaedic tissue regeneration//Cytokine Growth FactorRev.-2005-Vol.16-p. 329-345.


6. Wulsten D., Glatt V., Ellinghaus A. Time kinetics of bone defect healing in response to BMP-2 and GDF-5 characterised by in vivo biomechanics.//European cells and materials -2011-Vol.21- P.177-192.


7. Smith H., Adaline E., Volkman S. et all, Mechanical environment alters tissue formation patterns during fracture repair //J. Orthop. Res.- 2004-vol-22-p.1079-1085.


Скачать в формате PDF


← Назад к списку